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http://ciqa.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1025/761| Detección por hibridación molecular y caracterización molecular de aislados mexicanos del virus rugoso de tomate ToBRFV | |
| Ezequiel Linares Estrada | |
| Acceso Abierto | |
| Atribución-NoComercial-SinDerivadas | |
| Maestría en ciencias en agroplasticultura | |
| El virus rugoso del tomate (ToBRFV) fue reportado por primera vez en México en 2018.
Este virus afecta a las plantas de tomate, pimiento y berenjena y puede causar pérdidas
económicas significativas en su producción. En el presente trabajo de investigación se
desarrolló la técnica de detección por hibridación molecular (Dot-Blot) para ToBRFV con la
construcción por transcripción de dos sondas complementarias a dos regiones en los marcos
de lectura 3 y 4 del genoma viral de ToBRFV; BRF-S457 y BRF-S1065, respectivamente.
Las sondas fueron amplificadas clonadas y marcadas con Digoxigenina-11-UTP por
transcripción. Adicionalmente, se secuenciaron dos aislados de ToBRFV (ToBRFV-Mx-Ja
y ToBRFV-Mx-Hgo) provenientes de los estados de Jalisco e Hidalgo para su
caracterización. Por ello, se realizaron amplificaciones por RT-PCR del genoma total de cada
aislado y purificaciones. Los datos obtenidos fueron analizados para estudiar sus estructuras
genómica y poblacional.
sonda BRF-S457 perteneciente a la CP demostró capacidad de hibridación al ARN viral
tanto en extractos de ARN genómico como en ARN sintetizado in vitro con una
concentración de 0.085 ng/ml. Su umbral de detección del virus fue de 1 pg/µl.
Adicionalmente, se comprobó su aplicación en ensayo de prospección de un terreno y la
posibilidad de ser utilizada para detección semicuantitativa. La sonda BRF-S1065
perteneciente a la MP, mostró eficiencia en la detección de ARN viral a una concentración
de 1 ng/ml, su umbral de detección fue 50 pg/µl, y se comprobó la posibilidad de usarla para
análisis semicuantitativo.
Las secuencias de los aislados analizados fueron obtenidas a partir de cDNA amplificados por RT-PCR. En el caso de ToBRFV-Mx-Ja, se obtuvieron dos cDNA de 4.7 y 2.7 kb que fueron clonados posteriormente y en el caso de ToBRFV-Mx-Hgo, se obtuvieron siete fragmentos de tamaños variables entre 0.66 y 1.7 Kb. Los análisis posteriores mostraron que los dos aislados conservan su estructura genómica, se determinaron los 4 marcos de lectura ORFs y sus dominios funcionales descritos previamente en el género Tobamovirus al cual pertenece ToBRFV. No se detectaron inserciones o deleciones a lo largo del genoma comparado con secuencias de ToBRFV publicados en la base de datos NCBI. La estimación de la diversidad genética en posición sinónima de toda la población (genoma total) fue de 0.0071 ±0.0008 para la población regional (29 aislados de México, Estados Unidos y Canadá) y de 0.0057±0.0001 para la población mundial (64 aislados internacionales). Nuestros resultados muestran la eficiencia de las sondas generadas para detectar virus en ensayos de estudios con gran número de muestras y la posibilidad de ser utilizadas como técnica semicuantitativa de la carga viral. Hasta el momento no se ha confirmado la especificidad y la sensibilidad de las sondas por lo cual no es recomendable para diagnóstico temprano en el campo. Por otra parte, esta tesis ofrece datos de dos nuevos aislados de ToBRFV en México como primer paso para estudios posteriores. | |
| 2024 | |
| Tesis de maestría | |
| Español | |
| QUÍMICA | |
| Aparece en las colecciones: | Tesis de Maestría |
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